우리 사회와 일상생활에서 존재하는 화학물질 수는 계속 증가하고 있으며 이에 따라 유해 물질에 대한 인체 노출과 질병 등의 건강위해 가능성이 증가하고 있다.¹⁾ 그 중 플라스틱은 제작과 변형이 쉽고 가벼우며 내구성이 좋고 경제성과 실용성 때문에 전 세계에서 포장재, 건설업, 자동차부품, 전기∙전자제품, 생활 및 여가, 스포츠용품, 농자재 등 폭넓게 사용된다.²⁾ 대부분 플라스틱은 분해되거나 사라지지 않아 환경에 축적되고 특히, 플라스틱 파쇄에 의해 발생되는 미세플라스틱(microplastics, MPs)에 의한 환경 오염과 인체 영향 문제가 새롭게 대두되면서 미세플라스틱 연구가 활발하게 진행되고 있다.³⁾

체내 미세플라스틱이 흡수되면 입자 분포에 따라 림프계 또는 순환계에 도달하여 간, 신장, 비장, 심장 및 뇌를 포함한 이차 기관에 잠재적으로 축적되어 면역계와 세포의 건강에 영향을 줄 수 있다.⁴⁾ 폴리에틸렌 미세플라스틱(polyethylene microplastics, PE-MPs) 및 폴리스타일렌 미세플라스틱(polystyrene microplastics, PS-MPs)은 인간 유래 대뇌세포 및 상피세포에 산화스트레스를 유발한다는 것이 입증되었으며,⁵⁾ 크기가 더 작은 미세플라스틱은 세포막, 혈액-뇌 장벽을 통과해 미세플라스틱으로 유도된 독성물질의 대사와 해독작용에 따른 생체이용률을 증가시켜 전신 독성을 유발할 수 있다.⁶⁾ 또한, PE-MPs는 balb/c 생쥐를 이용한 8주간 반복 독성 시험을 수행한 결과에서 위 손상과 염증을 촉진하였고,⁷⁾ 생쥐의 간, 신장, 내장에 축적되어 간에서 에너지 및 지질 대사 방해, 산화스트레스 유발 및 신경독성 등의 부작용을 일으키는 것으로 보고되었다.^6,8,9)

이러한 미세플라스틱은 생활환경에 분포된 납(lead, Pb), 구리(copper, Cu), 카드뮴(cadmium, Cd), 수은(mercury, Hg)과 같은 중금속 및 내분비계 장애 물질과 같은 다른 오염물질에 흡착되어 생태계에 노출될 수 있으며, 잠재적으로 살아있는 유기체 형태로 오염물질을 전달하는 매개체가 될 수도 있다.^10-12) 흡착 정도를 좌우하는 것은 미세플라스틱 종류와 표면적 상태,　중금속의 농도, pH, 온도 등이며, 중금속의 경우 Pb>Cu>Cd 순서로 흡착 정도가 높았다.^13-16) 중금속이 흡착된 미세플라스틱은 먹이사슬을 통해 인체로 옮겨 체내 흡수와 독성을 높일 수 있다.

연성의 중금속으로 알려진 Pb는 유해성이 가장 많이 알려진 금속이다. Pb는 파괴되거나 소멸하지 않고 다른 물질로 변환되지 않는 특성이 있어, 혈액이나 뼛속에 축적되어 건강장해를 유발한다.¹⁷⁾ 특히, Pb는 신경계에 미치는 영향이 크며 장기간 Pb에 노출될 경우 인지 능력 장애를 일으킬 수 있다.¹⁸⁾ 어린이는 낮은 농도의 Pb 노출에도 민감하게 반응하여 변비, 복통, 구토, 체중감소 등의 소화기 증상과 두통, 피로, 무기력 및 과잉행동 그리고 지적 능력 장해 등을 일으킬 수 있음이 보고되었다.^19,20) 또한, 임산부의 Pb 노출은 유산 위험을 높이고, 성인 남성의 Pb 노출은 생식능력 저하를 유발시킬 수 있는 것으로 보고되었다.^21,22)

수많은 동물연구에서 나노 및 미세플라스틱 노출은 염증성 장 균형 손상, 장내 세포 불균형 및 면역세포 독성을 유발할 수 있음이 보고되었다. 또한, 미세플라스틱은 오염물질을 흡착하여 박테리아 병원균 성장을 촉진시킬 수 있는 것으로 알려졌다.²³⁾ 최근 PS-MPs (5 μm)와 Cd (10 μg/L)를 제브라피쉬에 복합노출 시 염증 및 산화스트레스를 유발하였으며,²⁴⁾ 농어(D. labrax juveniles)에서는 MPs (1~5 μm)와 Hg (0.016 mg/L) 노출 시 간과 아가미에서 산화스트레스를 일으켰다.¹⁰⁾ 잉어의 경우, PE-MPs와 Cd (2 mg/L)의 복합노출은 시너지 효과를 나타내며 혈액의 생화학적 변화를 유발하였다.²⁵⁾ 또한, MPs와 중금속의 복합노출은 미세조류 및 굴과 같은 수생생물에도 악영향을 미쳤다.²⁶⁾ 현재까지 연구들을 종합해 본 결과, 미세플라스틱과 중금속을 이용한 수생환경에서의 복합오염 연구는 많지만, 설치류와 같은 포유류를 이용한 미세플라스틱과 중금속 복합 독성연구는 부족하다. 특히, 미세플라스틱과 중금속 복합노출에 따른 면역 체계 평가는 미비하다.

대부분 미세플라스틱 일반적인 종류는 PE-MPs, PS-MPs 및 실리콘이다. 그 중 우리나라 한강 지류에서는 PE-MPs, 폴리테트라플루오로에틸렌 미세플라스틱(polytetra–fluoroethylene microplastics, PTFE-MPs), 폴리에스테르 미세플라스틱(polyestere microplastics, PES-MPs)이 많이 발견되며, 한강에 서식하는 잉어, 붕어, 블루길 등의 생선에서 PE-MPs와 PTFE-MPs가 발견되었다.²⁷⁾ 따라서 본 연구는 우리나라에서 흔하게 발견되는 플라스틱 유형 중 하나인 PE-MPs와 흡착 능력이 뛰어나고 우리 실생활에 많이 노출되고 있는 Pb를 대상으로 하였다. ICR 생쥐의 위내 PE-MPs와 Pb의 단독 혹은 복합형태로 28일 연속으로 노출시킨 후, 희생 부검을 통해 혈액학적 변화와 신체 면역 조절의 중요한 역할을 담당하는 비장 단일세포의 T 림프구 활성화를 통해 생성되는 사이토카인 수준을 비교분석하여 세포면역 영향을 평가하고자 하였다.

1. 실험동물 및 분류

본 실험은 감염, 내분비, 면역 등의 연구에 이용되는 ICR 생쥐를 사용하였다. (주)코아텍(Pyeongtaek, Korea)에서 7주령 수컷을 구입하였으며, 입수 후 9일간 순화 기간을 가졌다. 체중이 비슷한 개체를 무작위로 선정하여 투여물질에 따라 용매투여 대조군(control), PE-MPs 단독노출군, Pb 단독노출군, PE-MPs+Pb 복합노출군으로 각 군당 6마리로 구성하였다. 사육환경은 온도 22±3^°C, 상대습도 30~70%, 환기횟수 10~20 회/hr, 조명시간 12시간(08:00~20:00), 조도 150~300 Lux, 암모니아 농도 20 ppm 이하, 소음 60 dB 이하의 조건을 일정하게 유지하였다. 동물실험은 대구가톨릭대학교 동물실험윤리위원회의 규정을 준수하였으며, 동물실험윤리위원회의 승인(IACUC-2021-068호)을 받아 실시되었다.

2. 시험물질 및 투여

미세플라스틱은 0.74~4.99 µm Polyethylene Nanospheres (Cat. No: PENS-098, Cos-pheric LLC, Santa Barbara, CA, USA)로 밀도는 0.995 g/cc 소수성 미세플라스틱을 사용하였다. PE-MPs는 개봉 후 냉장 보관하였으며, Pb의 경우는 Lead (II) acetate tr-ihydrate (Cat. No: 467863, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였고, 개봉 후 상온 보관하였다. 투여 방법은 28일 동안 1일 1회 PE-MPs를 위내 투여하였으며 Pb는 28일 동안 음용수를 섭취하게 하였다. PE-MPs는 멸균증류수에 넣고 교반기를 이용하여 균질화시켰으며 선행연구를 참조하여 2 mg/mouse/day를 투여하였으며, Pb는 혈액에서 10~20 µg/dL의 Pb를 생성할 수 있는 0.1 mM 농도로 만든 음용수를 섭취하게 하였다.^19,28,29) 용매투여 대조군은 부형제인 멸균증류수를 위내 투여하였다.

3. 체중 측정

각 그룹의 실험동물을 투여개시일과 부검일에 전자저울(GF-3000, A&D Company, Seoul, Korea)을 사용하여 체중을 측정하였으며, 부검 전 체중에서 투여개시일 체중을 뺀 증체량(weight gain)을 구하여 각 개체별 체중 변화값을 확인하였다.

4. 혈액학적 분석

Isoflurane (HanaPhram, Seoul, Korea)으로 흡입마취한 뒤 개복하여 복대정맥에서 채혈한 혈액으로 자동혈액분석기(ADVIA 2120, Siemens, Germany)를 이용하여 백혈구, 헤모글로빈, 림프구, 단핵구, 호산구에 대한 정량적 분석을 측정하였다.

5. 비장 단일세포군(single cell suspension) 배양 및 T 림프구 활성화

부검 시 얻은 주요 면역 장기인 비장을 채취하여 멸균된 슬라이드글라스(Fisherbrand, Pittsburgh, PA, USA)를 이용하여 단일세포화하였다. 이후 RBC lysis buffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 적혈구를 용해시키고, DPBS로 용해된 적혈구 등을 세척하였다. 단일세포화가 끝난 비장세포는 24-well plate에 culture RPMI-1640 (cRPMI)과 함께 0.5×10⁶ cells/well로 배양하였다. cRPMI의 조성으로는 RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT, USA), 1 mM sodium pyruvate (BioWhittaker, Lonza, MD, USA), 1% sodium bicarbonate, 50 mM 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), 10% heated in activated fetal bovine serum (FBS, Hyclone), 1% Penicillin-Streptomycin solution (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였다. 단일화된 비장세포의 CD4⁺ T 림프구 활성화를 위해 immobilized anti-CD3e mAb (5 μg/0.5×10⁶ cells, purified NA/LE Hamster anti-mouse CD3e, BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 사용하여 활성화하였다.

세포는 48시간 동안 37^°C 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 4^°C, 10,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 얻었고 분석하기 전까지 –20^°C에 보관하였다.

6. T 림프구 내 사이토카인 측정

T 림프구 활성화 배양액 내 존재하는 사이토카인 수준을 Sandwich Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay 방법으로 정량하였다. 각 지표를 확인하기 위한 Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α), InterLeukin-6 (IL-6), Interferon-gamma (IFN-γ), 및 InterLuekin-4 (IL-4) kit는 BD Biosciences 제품을 사용하였다. 96-well Immulon 4 plate (Dynex, Chantilly, VA, USA)에 non-specific binding을 위해 10% FBS-PBS로 blocking 하였으며, 배양액은 TNF-α는 1/3, IFN-γ는 1/30로 희석하고 IL-6 및 IL-4는 희석 없이 분석하였다. Epoch Microplate Spectrophotometer (Bio-Tek, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 570 nm 및 450 nm 파장에서 흡광도를 측정한 후, Gen5 Data Analysis Software (Bio-Tek)를 통해 정량하였다.

7. 통계 분석

실험을 통해 얻은 모든 결과의 통계 처리는 Student’s T test를 통해 용매투여 대조군과 시험군과의 유의성 검정을 하였다. 모든 결과값은 평균±표준오차(standard error, SE)로 나타냈다. 유의수준은 p-value<0.05에서 검정하였다.

1. 체중 변화

PE-MPs와 Pb의 단독노출군 및 PE-MPs+Pb 복합노출군의 4주 노출 전후의 체중 변화를 확인하였다. 용매투여 대조군은 투여개시일부터 부검 전까지 2.53±0.44 g의 증가를 보였다. PE-MPs 단독노출군은 2.75±0.42 g, Pb 단독노출군은 2.51±0.66 g으로 용매투여 대조군과 차이가 없었으며, PE-MPs+Pb 혼합노출군은 1.87±0.62 g 증가로 용매투여 대조군 평균과 비교해 23% 감소된 수준이지만 통계적인 차이는 없었다(Table 1).

Table 1 . Body weight gains (g) of groups.

Day	Group
	Control	PE-MPs	Pb	PE-MPs+Pb
1st day (g)	36.02±0.81	36.05±0.68	36.59±0.53	36.85±0.65
Sacrificed day (g)	38.55±1.24	38.81±0.59	39.10±0.96	38.73±0.50
Weight gain (g)	2.53±0.44	2.75±0.42	2.51±0.66	1.87±0.62

Body weight of groups were measured on the days of first and twenty eighth administration (Control: 0 mg/mouse/administration, Polyethylene microplastic [PE-MPs]: 2 mg/mouse/administration, Pb: 0.1 mM in distilled water, PE-MPs+Pb: 2 mg/mouse/administration+0.1 mM in distilled water) during 4 weeks. Number of animals were 6 for each group, respectively. Data are expressed as means±standard error..

2. 혈액학적 분석 결과

PE-MPs와 Pb의 단독노출 및 PE-MPs+Pb의 복합노출에 따른 혈액학적 변화 검사 결과에서 백혈구수는 용매투여 대조군에서 3.84±0.66×10³/μL를 나타냈고 PE-MPs 단독노출군은 2.68±0.49×10³/μL로 용매투여 대조군 평균에 비해 30% 감소하였다. Pb 단독노출군 2.94±0.57×10³/μL, PE-MPs+Pb 복합노출군 2.96±0.60×10³/μL로 두 그룹 모두 약 23% 감소된 결과를 확인할 수 있었다. 헤모글로빈의 농도는 Pb의 단독노출에서 12.8±0.20 g/dL로 용매투여 대조군의 13.8±0.40 g/dL와 비교해 통계적으로 유의하게 감소하였다. 림프구 수준은 용매투여 대조군 2.36±0.37×10³/μL에 비해 PE-MPs 단독노출군 1.91±0.41×10³/μL, Pb 단독노출군 2.03±0.29×10³/μL, PE-MPs+Pb 복합노출군 1.92±0.45×10³/μL로 감소된 경향을 보였다. 호산구는 용매투여 대조군 4.98±0.80%를 나타냈으며 2.15±0.45%를 나타낸 PE-MPs+Pb 복합노출군은 용매투여 대조군과 비교해 통계적으로 유의하게 감소하였다(Table 2).

Table 2 . Comparison of hematologic parameters.

Indicator	Units	Group
		Control	PE-MPs	Pb	PE-MPs+Pb
WBC	103/μL	3.84±0.66	2.68±0.49	2.94±0.57	2.96±0.60
HGB	g/dL	13.8±0.40	13.5±0.20	12.8±0.20*	13.0±0.40
LYM	103/μL	2.36±0.37	1.91±0.41	2.03±0.29	1.92±0.45
MONO	%	2.18±0.36	2.57±0.53	1.66±0.21	3.65±0.83
EOS	%	4.98±0.80	5.37±0.88	3.95±0.54	2.15±0.45*

Hematologic parmeters of groups were measured on the sacrificed day (Control: 0 mg/mouse/administration, Polyethylene microplastic [PE-MPs]: 2 mg/mouse/administration, Pb: 0.1 mM in distilled water, PE-MPs+Pb: 2 mg/mouse/administration+0.1 mM in distilled water). Number of animals were 6 for each group, respectively. Data are expressed as means±standard error. *p<0.05, compared to the Control and Pb or PE-MPs+Pb..

WBC: white blood cells, HGB: bemoglobin, LYM: lymphocyte, MONO: monocyte, EOS: eosinophil..

3. 비장세포 T 림프구 배양액을 이용한 사이토카인 분석 결과

비장 단일세포에서 T 림프구를 활성화한 배양액으로부터 염증성 사이토카인 수준을 분석하였다. TNF-α와 IL-6는 대표적인 친염증성 사이토카인으로 측정 결과 용매투여 대조군(TNF-α: 306.6±65.6 pg/mL, IL-6: 181.0±71.9 pg/mL)과 Pb 단독노출군(TNF-α: 301.3±4.5 pg/mL, IL-6: 172.2±46.5 pg/mL)에서 그룹 간 차이는 없었다. 하지만 TNF-α는 PE-MPs 단독노출군에서 333.5±81.2 pg/mL, PE-MPs+Pb 복합노출군에서 366.3±27.3 pg/mL로 용매투여 대조군에 비해 증가하는 경향을 나타냈으며, IL-6의 경우 PE-MPs 단독노출군에서 122.8±33.3 pg/mL, PE-MPs+Pb 복합노출군에서 133.6±36.6 pg/mL로 용매투여 대조군에 비해 감소하였다 (Fig. 1A, 1B).

Figure 1. Levels of cytokines produced in culture supernatant of ex vivo stimulated spleen. (Control: 0 mg/mouse/administration, Polyethylene microplastic [PE-MPs]: 2 mg/mouse/administration, Pb: 0.1 mM in distilled water, PE-MPs+Pb: 2 mg/mouse/administration+0.1 mM in distilled water). Number of animals were 6 for each group, respectively. Data are expressed as means±standard error.

IFN-γ는 보조 T 림프구 type 1 (Helper T lymphocyte type 1, T_H1)으로 분화를 유도하여 세포 안에서 바이러스 증식 방어 등 면역 반응과 관련되어 있으며 IL-4는 보조 T 림프구 type 2 (Helper T lymphocyte type 2, T_H2)로 분화를 유도하여 알러지와 염증 매개와 관련하는 역할로 알려져 있다. IFN-γ 측정한 결과에서 용매투여 대조군은 14,120±2,965 pg/mL를 보였으며, PE-MPs 단독노출군은 17,670±5,443 pg/mL 및 PE-MPs+Pb 복합노출군은 24,390±5,212 pg/mL로 용매투여 대조군 평균에 비해 각각 25%와 73% 증가를 보였다. Pb 단독노출군은 15,101±2,812 pg/mL의 수준이었다. IL-4 측정결과에서는, PE-MPs 단독노출군은 158.1±35.5 pg/mL 및 PE-MPs+Pb 복합노출군은 236.2±50.3 pg/mL로 용매투여 대조군 309.0±110.05 pg/mL로 감소되는 경향을 보였으며, Pb 단독노출군에서는 402.3±110.1 pg/mL였다(Fig. 1C, 1D).

4. 비장세포 배양액 내 IFN-γ/IL-4 ratio 평가

IFN-γ/IL-4 ratio는 T_H1 또는 T_H2 반응성에 대한 면역 편향성을 알 수 있는 면역지표이다. 그 결과, 용매투여 대조군(69.4±17.6)과 비교하여 PE-MPs 단독노출군(108.9±30.1)과 PE-MPs+Pb 복합노출군(115.6±26.8)으로 용매투여 대조군보다 높은 IFN-γ/IL-4 ratio가 관찰되었다. Pb 단독노출군은 68.6±28.4로 용매대조군과 비슷한 수준을 보였다(Fig. 2).

Figure 2. The IFN-γ/IL-4 ratio was calculated by dividing the amount of IFN-γ by the amount of IL-4 in the same supernatant (Control: 0 mg/mouse/administration, Polyethylene microplastic [PE-MPs]: 2 mg/mouse/administration, Pb: 0.1 mM in distilled water, PE-MPs+Pb: 2 mg/mouse/administration+0.1 mM in distilled water). Number of animals were 6 for each group, respectively. Data are expressed as means±standard error.

대부분 화학물질에 대한 위해성 평가는 개별 물질의 노출 수준을 파악하여 개별 잔류 허용 기준을 설정하는 데 활용되고 있다. 그러나 실생활에서 사람은 매일 다양한 노출 경로로 여러 화학물질에 동시에 노출되며 이와 같은 복합 화학물질은 여러 독성학적 상호작용으로 예상치 못한 위해영향을 유발할 수 있다. 따라서 본 연구는 PE-MPs 단독노출군, Pb 단독노출군, PE-MPs+Pb 복합노출군을 설정해 각 해당 물질 및 복합노출에 대한 독성영향 중 비장 단일세포의 T 림프구 활성화를 통해 생성된 사이토카인 수준을 비교분석하여 세포면역 영향을 평가하였다.

활성화된 CD4⁺ T 세포는 T_H1 세포와 T_H2 세포로 분화되어 체내 기초적인 면역기능을 담당하고 있다. 분화된 T_H1 세포와 T_H2 세포는 10년 이상의 연구결과를 통해 각각 고유한 사이토카인을 분비하는데, T_H1 세포는 TNF-α와 IFN-γ와 같은 염증성 사이토카인을 분비하며 생성된 사이토카인들은 류마티스 관절염, 인슐린 의존성 당뇨병, 자가면역 뇌염 등을 포함한 만성적 자가면역 질환을 특징으로 가지고 있다. 이와는 반대로 T_H2 세포는 IL-4를 분비하여 박테리아 및 기생충과 같은 특정 세포외 병원체에 대한 보호를 하며 알러지와 같은 천식 반응에 관여한다.³⁰⁾ IL-6은 T_H2 세포의 분화를 유도하며 반면에 T_H1 세포의 분화를 억제하는 것으로 알려져 있다.³¹⁾ 치군군야 바이러스(chikungunya virus)로 유도된 관절염 질환 C57BL/6J 마우스에 1 μm PS-MPs를 노출 시 상대적으로 T_H1 반응, 자연살해세포 및 호중구를 상승시켰으며,³²⁾ 임신 8일차에서 출산후 21일 동안 0.1 mM의 Pb에 노출된 balb/c 어미 생쥐와 500 ppm Pb에 임신기간 동안 노출된 Fisser 344 어미 랫드의 자손들은 면역 항상성을 교란시켜 T_H1 반응성보다 T_H2 반응성에 대한 불균형을 초래하는 것으로 보고되었다.^33,34) 본 연구에서 PE-MPs 단독노출군 및 PE-MPs+Pb 복합노출군은 T_H1 세포에 의해 분비되는 TNF-α와 IFN-γ의 수준을 높이고 T_H2 세포를 통해 분비되는 IL-4 수준을 감소시켰으며 면역편향성을 확인한 IFN-γ/IL-4 ratio에서도 PE-MPs에 의해 T_H1 반응이 높다는 것을 확인하여 이전 연구결과와 일치하는 것을 확인하였다.^32-34)

T_H1/T_H2는 서로 상호의존적으로 작용하기 때문에 T_H1/T_H2 불균형은 면역반응이 다르며 질병 또한 다르게 나타난다. 흑생종 환자의 경우 일반인에 비해 T_H1의 IL-2와 IFN-γ의 발현이 현저하게 낮았으며 T_H2의 IL-4, IL-6의 수준이 상승하여 T_H1/T_H2의 불균형이 되어있으며,³⁵⁾ 유방암 환자에서도 T_H2 사이토카인 상승과 T_H1 우성 반응을 보이는 환자는 더 높은 생존율과 더 낮은 암 재발률을 보였다.³⁶⁾ 본 연구결과에서 PE-MPs 단독노출군 및 PE-MPs+Pb 복합노출군의 결과는 Pb 노출과 상관없이 PE-MPs에 따라 사이토카인 결과가 나오는 것을 확인하여 28일 동안 실험동물 체내에서 PE-MPs와 Pb가 동시에 노출되었을 때 Pb보다 PE-MPs에 의한 면역 변화 반응이 먼저 일어나는 것으로 관측되었다. 위와 같은 결과는 미세플라스틱과 중금속의 복합노출 시 종양 혹은 알러지, 천식 질환과 관련 있는 T_H2 반응보다는 T_H1 우세반응과 관련 있는 염증성 자가면역질환 연구가 더 중요함을 시사한다. 또한, 추가연구를 통해 자가면역질환과 관련있는 T_H17 세포와 T_H17 세포에 의해 분비되는 IL-12, IL-17, IL-23 사이토카인의 연구도 필요할 것이다.³⁷⁾

Pb 단독노출군의 경우 T_H2 반응과 관련 있는 IL-4 수준만 증가하였으며 TNF-α, IFN-γ, IL-6의 수준은 용매투여 대조군과 차이를 확인할 수 없었다. 다만, 기존 연구에서 Pb는 초기 발달과정에서 독성효과를 발휘하며 어릴수록 Pb 노출에 더욱 민감하게 반응할 수 있다.^33,34) 따라서 본 연구에서 사용된 9주령부터 13주령까지 투여된 Pb 노출군은 상대적으로 독성영향이 미비할 수 있다. 이번 연구에서 Pb 단독노출군과 PE-MPs+Pb 복합노출군의 혈중 Pb 농도를 분석하지 않았다. 혈액 중 Pb 농도가 20 µg/dL일 때 헤모글로빈의 수치가 감소하고 빈혈 위험이 있다.³⁸⁾ Pb 단독노출군은 용매투여 대조군과 비교해 혈액 중 헤모글로빈 수준이 통계적으로 유의하게 감소하였고, PE-MPs+Pb 복합노출군의 혈액 중 헤모글로빈 수준 또한 용매투여 대조군보다 낮은 수준임을 확인하였다. 따라서, 본 연구에서 설정된 Pb의 0.1 mM의 농도는 적정하다고 보여진다. 독성을 예측할 수 있는 지표로 체중 변화를 활용할 수 있다.³⁹⁾ PE-MPs와 Pb의 단독노출에 따른 증체량은 용매투여 대조군과 차이가 없었으나, PE-MPs+Pb 복합노출군은 용매투여 대조군과 비교해 증체량이 감소되었다. 독성 세기를 단순비교하기 어렵지만, PE-MPs+Pb의 복합노출은 단독노출보다 체내 소화기관에 미치는 영향이 큰 것을 확인하였다. 다만, 정확한 독성평가를 위해 미세플라스틱과 중금속 복합노출 시 체중 변화를 유도할 수 있는 장내 장 균형 손상, 장내 세포 불균형, 프로바이오틱스 및 병원성 박테리아 구성 등의 연구가 필요하다.

본 연구결과로 PE-MPs와 Pb의 복합노출에 따른 유의한 면역반응은 확인할 수 없었다. 다만, 본 연구를 통해 PE-MPs는 T_H1 우세반응을 보이고 Pb는 T_H2 우세반응을 보였던 기존 연구와 같은 결과를 얻었으며, PE-MPs와 Pb가 복합노출되었을 때 PE-MPs의 면역변화 반응은 Pb보다 우세하게 일어나는 것을 확인하였다. 중금속이 흡착된 MPs는 중금속의 대체 노출 경로로 작용하여 중금속의 분포, 생체 축적 및 독성을 증가시킬 수 있으나,²⁶⁾ 본 연구는 PE-MPs에 Pb가 흡착된 형태로 동시에 노출시키지 않았다. 투여 방법의 경우, PE-MPs는 위내투여를 하였으며 Pb는 음용수에 녹여 실험동물에 노출시켰다. 실제 Pb 단독노출군처럼 음용수에 녹여 자연스러운 섭취가 좋은 방법일 수 있으나 PE-MPs의 소수성 특징으로 물에 녹지 않아 정확한 양의 투여를 위해 PE-MPs는 위내 투여 방법을 이용하였다. 또한, Pb의 정확한 투여량을 환산하기 위한 음수량 측정결과를 제시하지 못하였다. 이러한 제한점에도 불구하고 본 연구 자료는 추후 포유류의 이용한 미세플라스틱과 중금속 복합노출에 따른 T_H1 반응 및 T_H2 반응 관련 질환의 상관성 연구를 위한 하나의 근거자료로 사용할 수 있으며 더 나아가 다양한 복합노출의 독성평가 필요성에 대한 중요한 근거자료로 활용될 수 있을 것이다.

28일 동안 PE-MPs와 Pb 각각을 단독노출 및 복합노출 시켰을 때 나타나는 세포면역 변화를 확인한 결과 PE-MPs 단독노출 및 PE-MPs+Pb 복합노출에서 T_H1 우세반응이 일어났다. 비록 PE-MPs에 Pb가 흡착된 상태로 노출되진 않았지만 위내 동시에 축적된 것을 고려하면, T_H2 우세반응을 유발하는 Pb 단독노출군에 비해 PE-MPs가 노출된 PE-MPs 단독노출 및 PE-MPs+Pb 복합노출 그룹에서 T_H1 우세반응이 유도된 것은 28일 동안 노출시 Pb보다 PE-MPs 반응이 더 우세하게 일어날 수 있음을 시사한다. 추후 미세플라스틱과 중금속 복합노출의 만성 독성평가의 추가연구 통한 비교분석은 필요하지만, 본 연구의 결과는 미세플라스틱과 중금속 복합노출에 따른 T_H1 우세반응을 검증을 위한 연구의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.

본 연구는 한국화학물질관리협회 화학물질 안전관리 전문인력 양성 사업의 지원을 받아 수행되었음.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

이경우(대학원생), 김창열(교수)