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Original Article

J Environ Health Sci. 2024; 50(3): 201-211

Published online June 30, 2024 https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Copyright © The Korean Society of Environmental Health.

Evaluation of Single and Binary Mixture Toxicity of Organic UV-Filters Using H295R Cells

H295R 세포를 활용한 유기 UV-Filters의 단일 및 혼합독성 평가

Bomee Lee1 , Inhye Lee1,2 , Kyunghee Ji3*

이봄이1, 이인혜1,2, 지경희3*

1Institute of Natural Sciences, Yongin University, 2Department of Environmental Health Sciences, School of Public Health, Seoul National University, 3Department of Occupational and Environmental Health, Yongin University

1용인대학교 자연과학연구소, 2서울대학교 보건대학원 환경보건학과, 3용인대학교 산업환경보건학과

Correspondence to:*Department of Occupational and Environmental Health, Yongin University, 134 Yongindaehak-ro, Cheoin-gu, Yongin 17092, Republic of Korea
Tel: +82-31-8020-2747
Fax: +82-31-8020-2886
E-mail: kyungheeji@yongin.ac.kr

Received: May 13, 2024; Revised: June 6, 2024; Accepted: June 18, 2024

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Highlights

ㆍ Avobenzone, homosalate, octisalate, octinoxate, and octocrylene had estrogenic effects.
ㆍ Homosalate and octisalate decreased testosterone, suggesting an antiandrogenic effect.
ㆍ Co-exposure to octinoxate and homosalate enhanced sex hormone disruption in H295R cells.
ㆍ Upregulation of 17βHSD and CYP19A1 genes supports increased E2 due to combined exposure.

Graphical Abstract

Background: Organic ultraviolet (UV) filters are widely used in sunscreen products and have been identified as an emerging contaminant. Organic UV filters co-exist with multiple components, but their mixture toxicity remains largely unknown.
Objectives: We investigated the toxicity of single and binary mixtures of commonly used UV-filters using the human adrenocarcinoma (H295R) cell line.
Methods: After exposure to non-cytotoxic concentrations of avobenzone (AVO), homosalate (HS), octisalate (OS), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC), the levels of testosterone (T) and 17β-estradiol (E2) were measured. The median effective concentration (EC50) values for the E2 of the individual substances were used to determine the mixture effect of four binary combinations: OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, and OMC+OC. The synergistic, additive, and antagonistic effects of the mixture were determined by calculating toxic units (TU). To examine the mechanism of mixture toxicity, eight genes involved in steroidogenesis were analyzed using the real-time polymerase chain reaction.
Results: The significant increase in E2 in H295R cells exposed to AVO, HS, OS, OMC, and OC suggest an estrogenic effect of the tested UV-filters. A significant decrease in T was observed in cells exposed to HS and OS. EC50 values for E2 increase were 105 nM for AVO, 110 nM for HS, 120 nM for OS, 55 nM for OMC, and 80 nM for OC. Both binary mixtures consisting of OMC+HS and OMC+OS have synergistic effects.
Conclusions: Our results showed that five types of UV-filter substances increase E2 in H295R cells. We examined the mixture toxicity in terms of increased estrogenicity and confirmed that E2 significantly increased when OMC was mixed with a salicylate-based UV-filters. These findings highlight the importance of determining the impact of UV filter mixtures.

KeywordsMixture, sex hormone, steroidogenesis, UV filter

자외선 차단제에는 자외선의 피부 흡수를 막기 위한 활성 성분과 비활성 성분이 혼합되어 있다.1) 자외선 차단제의 활성 성분은 UV-filter로, 물리적 UV-filter와 화학적 UV-filter로 분류된다.2) 물리적 UV-filter는 피부 표면에 보호막을 형성하여 자외선을 반사시키며, 티타늄디옥사이드(titanium dioxide)와 징크옥사이드(zinc oxide)가 주로 사용된다.3) 화학적 UV-filter는 피부에 흡수된 자외선 에너지를 열 형태로 변환하여 밖으로 내보내며, 아보벤존(avobenzone, AVO), 호모살레이트(homosalate, HS), 옥티살레이트(octisalate, OS), 옥티노세이트(octinoxate, OMC), 옥토크릴렌(octocrylene, OC) 등의 성분들이 주로 사용된다.4) 개별물질은 좁은 범위의 자외선 파장만을 흡수하기 때문에 광안정성과 더 넓은 범위의 자외선을 차단하기 위한 목적으로 여러 UV-filter를 섞어 쓰게 된다.5)

UV-filter는 해양 레크리에이션 활동6) 또는 폐수처리장에서 불완전하게 제거되어 물 환경을 오염시킬 수 있다.7) 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)의 지표수(surface water) 검출 수준을 Table 1에 제시하였다. 아보벤존(AVO)은 하와이 해변에서 최대 70,970 ng/L,8) 튀니지 지표수에서 최대 97.7 ng/L9)가 검출되었다. 호모살레이트(HS)는 홍콩 지표수에서 최대 2,812 ng/L,10,11) 하와이 해변에서 최대 686.6 ng/L,12) 체서피크만에서 최대 187.9 ng/L,13) Qinhuai 강과 Yangtze 강에서 최대 3.1 ng/L14)가 검출되었다. 옥티살레이트(OS)는 호모살레이트(HS)보다 비교적 낮은 농도로 검출되었으며, 홍콩 지표수에서 최대 1,030 ng/L,10,11) 하와의 해변에서 최대 121.2 ng/L12)로 확인되었다. 옥티노세이트(OMC)는 홍콩 지표수에서 최대 4,043 ng/L,10,11) 튀니지에서 1,420 ng/L,9) 체서피크만에서 28.9 ng/L,13) Qinhuai 강과 Yangtze 강에서 7.9 ng/L14)로 검출되었다. 옥토크릴렌(OC)은 하와이 해변에서 최대 13,350 ng/L,8) 홍콩 지표수에서 최대 6,812 ng/L10)로 검출되었다.

Table 1 Concentration of avobenzone, homosalate, octisalate, octinoxate, and octocrylene in the water environment

ChemicalsLocationNDF (%)Concentration (ng/L)
AM (min-max)
Ref.
AvobenzoneWaialea Bay, Hawaii, USA310022,020 (3,430~35,190)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,740 (3,320~5,160)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA510026,372 (9,400~70,970)8)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia65.5616.3 (9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Tunisia65.563.6 (9)
HomosalateHong Kong, China6076NA (66~2,812)10)
Tokyo, Japan8100NA (65~110)10)
New York, USA667NA (91~114)10)
Los Angeles, USA4100NA (142~270)10)
Bangkok, Thailand2100NA (29~59)10)
Hong Kong, China367516.18 (3.6~41.84)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA18100171.1 (38.5~465.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2114.261.5 (12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA18100215.4 (93.7~686.6)12)
Chesapeake Bay, USA1410090.2 (15.5~187.9)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (1.1~3.1)14)
OctisalateHong Kong, China6059NA (61~1,030)10)
Tokyo, Japan888NA (71~95)10)
Los Angeles, USA450NA (53~120)10)
Chaozhou, China367NA (121~128)10)
Bangkok, Thailand2100NA (28~56)10)
Hong Kong, China365312.74 (0.85~27.78)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA1810055.8 (27.5~121.2)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA1810053.4 (39.1~79.1)12)
Waialea Bay, Hawaii, USA31002,360 (1,400~3,600)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21003,400 (1,700~5,100)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51005,420 (1,100~13,600)8)
OctinoxateHong Kong, China6093NA (89~4,043)10)
Tokyo, Japan863NA (46~95)10)
New York, USA683NA (89~150)10)
Los Angeles, USA475NA (91~138)10)
Shantou, China475NA (52~78)10)
Chaozhou, China333NA (10)
Bangkok, Thailand2100NA (88~95)10)
Arctic1471NA (25~66)10)
Hong Kong, China366721.53 (3.84~55.65)11)
Chesapeake Bay, USA1492.826.9 (13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (4.5~7.9)14)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia6100583 (188~1,420)9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Mahdia, Tunisia666254 (9)
Hammamet Bay, Mahdia, Tunisia63350.9 (9)
OctocryleneHong Kong, China60100NA (103~6,812)10)
Tokyo, Japan875NA (87~108)10)
New York, USA683NA (117~128)10)
Los Angeles, USA4100NA (145~377)10)
Shantou, China475NA (75~107)10)
Chaozhou, China367NA (36~102)10)
Bangkok, Thailand2100NA (153~205)10)
Arctic1443NA (26~31)10)
Hong Kong, China3610025.00 (2.15~71.90)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA181005.2 (0.3~25.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2185.75.3 (0.3~45.5)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA181008.0 (0.3~29.1)12)
Chesapeake Bay, USA1410024.8 (11.9~43.7)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (0.4~0.9)14)
Waialea Bay, Hawaii, USA31008,090 (2,730~13,350)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,870 (90~3,650)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51007,640 (4,540~12,790)8)

AM: arithmetic mean, DF: detection frequency, LOD: limit of detection, NA: not available, Ref: reference.


최근 화학적 UV-filter가 생식 및 발달독성, 신경독성, 내분비계 교란독성을 유발함을 입증한 연구가 증가하고 있다. 예를 들어, 호모살레이트(HS)는 수컷 제브라피쉬의 테스토스테론(T)을 감소시켜 항안드로겐성을 유발하였다.15) 아보벤존(AVO)과 옥티노세이트(OMC)는 제브라피쉬 치어의 발달을 지연시키고, 갑상선호르몬인 티록신(thyroxine)의 합성과 분비를 감소시켰다.16) 옥티노세이트(OMC)의 광분해산물인 4-methoxybenzaldehyde (4-MBA)는 원물질에 비해 제브라피쉬 배아/치어의 발달독성이 더 크게 나타났으며, 아세틸콜린에스테라제 활성을 저하시키고 산화스트레스를 유발하였다.17) 환경 중에서 검출이 가능한 농도(50 μg/L)의 옥토크릴렌(OC)에 노출된 제브라피쉬에서는 발달 지연, 아세틸콜린에스테라제 활성 저하, 부레와 눈의 조직학적 변화, 산화스트레스 유발이 확인되었다.18) 이러한 독성 자료를 토대로 최근 자외선 차단제 활성 성분의 인체 안전성에 대한 조사가 미국과 유럽을 포함한 여러 기관에서 강화되고 있다. 2019년 미국 식품의약국(US FDA)은 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)을 포함하여 12개 화학적 UV-filter에 대해 추가적인 안전성 자료가 필요하다고 언급했다.19) 유럽 위원회(European Commission)는 추가평가를 요청하는 내분비계 교란물질 목록에 여러 UV-filter를 포함시켰다.20)

제품 뿐만 아니라 환경 중으로 배출된 자외선 차단제는 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 다양한 자외선 차단제 성분이 혼합되었을 때 나타날 수 있는 독성영향에 대해 연구가 필요하다. 최근 몇몇 연구에서는 다빈도로 혼합되는 자외선차단제가 혼합되었을 때 항안드로겐성 등 내분비계 교란독성 증가, 산화스트레스 유발과 지질 및 단백질 손상이 증가할 수 있다고 보고하였다.15,21,22) 예를 들어, 화장품 내에 다빈도로 혼합되는 2-메틸레조르시놀(2-methylresorcinol), 부틸화히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 아보벤존(AVO)의 내분비계 교란독성을 조사한 연구에서는 2-메틸레조르시놀+아보벤존(AVO) 조합이 항안드로겐성을 가짐을 확인하였다.21) 호모살레이트(HS)는 아보벤존(AVO)과 혼합노출될 때 H295R 세포와 수컷 제브라피쉬에서 항안드로겐성이 더욱 증가되었다.15) 아보벤존(AVO)과 나노산화아연(nano ZnO)이 갯지렁이(lugworm)에 혼합 노출되었을 때 산화스트레스가 증가하였고 지질 과산화물이 축적되어 지질 및 단백질 손상이 증가하였다.22) 그러나, 아보벤존(AVO)과 호모살레이트(HS) 이외의 다른 자외선 차단제 성분들에 대한 혼합독성 연구는 부족하다.

본 연구에서는 H295R 세포를 활용하여 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 성호르몬인 17β-estradiol (E2)와 testosterone (T)에 미치는 영향을 확인하였고, 에스트로겐성이 가장 높은 옥티노세이트(OMC)와 다른 물질을 혼합할 때의 E2의 독성 변화를 살펴보았다. H295R 세포는 미분화된 태아 부신 세포의 생물학적 특성을 나타내지만, 성인 부신 피질, 난소, 고환에서 발견되는 스테로이드 호르몬을 생성한다.23) 이 세포는 환경오염물질이 스테로이드 성호르몬 뿐만 아니라 효소 활성 및 유전자 발현에 대한 영향을 평가하는 데 사용되어 왔으며,24,25) OECD 시험지침 456 (H295R steroidogenesis assay)으로 개발되었다.26) 최근에는 ToxCast 프로그램의 일부로 H295R 세포가 고속대량 스크리닝(high-throughput screening)에 활용되고 있다.27) 본 연구에서는 H295R 세포를 이용한 성호르몬 혼합 독성 비교 방법을 제안하였고, 스테로이드호르몬 생합성과 관련된 유전자 발현 변화를 조사하여 독성 기전을 제시하였다.

1. 시험물질과 H295R 세포의 배양

시험물질인 아보벤존(AVO, CAS no. 70356-09-1), 호모살레이트(HS, CAS no. 118-56-9), 옥티살레이트(OS, CAS no. 118-60-5), 옥티노세이트(OMC, CAS no. 5466-77-3), 옥토크릴렌(OC, CAS no. 6197-30-4)과 용매로 사용한 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)는 Merck Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMSO에 시험물질을 녹여 저장용액(stock solution)을 제조하였고, 시험용액(test solution)은 저장용액을 DMSO로 희석하여 제조하였다.

H295R 세포(#CRL-2128)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양받았다. 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)과 Ham’s F-12 nutrient medium이 1:1로 혼합된 배지(DMEM/F12; GibcoTM 11320033, Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)에 ITS+premix (Corning® 354352, Corning, NY, USA), 2.5%의 Nu-serum (Corning® 355100), 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하였다. H295R 세포는 5% 이산화탄소-95% 공기, 37°C 조건의 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 confluence가 80% 가량이 되면 분주하였다.

2. MTT 분석을 이용한 세포독성 확인

본 연구에서는 OECD TG 45626)에 따라 H295R 세포를 24-well 플레이트의 각 well에 3.0×105 cells/mL의 밀도로 분주하였다. 세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 24시간 동안 5% 이산화탄소-95% 공기, 37°C 조건의 인큐베이터에서 배양한 후, 대조군, 용매 대조군(DMSO 0.1%), 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)의 6개 농도(0.3, 1, 3, 10, 30, 100 μM)에 48시간 노출하였다. 각 농도군 당 3개의 반복군을 두었으며, 3번의 반복 실험을 통해 총 9개의 반복군을 확보하였다. 노출이 종료된 후 MTT 분석을 통해 세포의 생존율을 확인하였다. MTT 분석에서 세포 독성이 없는 농도(즉, 용매 대조군과 비교하여 세포 생존율이 90% 이상)를 성호르몬 분석을 위한 노출 농도로 지정하였다.

3. 개별 시험물질 노출과 성호르몬 분석

개별 시험물질 노출과 성호르몬 분석은 OECD TG 456에 제시된 방법26)에 따라 진행하였다. 즉, H295R 세포를 24-well 플레이트의 각 well에 3.0×105 cells/mL의 밀도로 분주하여 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 대조군, 용매 대조군(DMSO 0.1%), 아보벤존(AVO; 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000 nM), 호모살레이트(HS; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥티살레이트(OS; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥티노세이트(OMC; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥토크릴렌(OC; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM)에 48시간 노출하였다. 각 농도군 당 3개의 반복군을 두었으며, 3번의 반복 실험을 통해 총 9개의 반복군을 확보하였다. 시험이 종료된 후 배지를 수집하여 성호르몬 분석에 사용하였다.

배지(500 μL)를 2.5 mL의 디에틸에테르(diethyl ether)로 2번 추출하고, 질소농축기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)에 동봉된 완충액(buffer) 300 μL로 녹인 후, E2 분석을 위한 시료는 1:1로, T 분석을 위한 시료는 1:75로 희석하였다. 호르몬은 ELISA 키트의 매뉴얼에 따라 E2 (Cat 번호 582251) 및 T (Cat 번호 582701)를 분석하였다.

4. 혼합 시험물질 노출과 성호르몬 분석

개별 시험물질 중 E2에 대한 반수영향농도(median effect concentration EC50) 값이 가장 낮아 에스트로겐성이 가장 큰 것으로 확인된 물질(옥티노세이트[OMC])을 중심으로 다른 물질을 혼합하여 다른 4개의 물질을 binary mixture로 혼합하였다(OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, OMC+OC). 호르몬 변화(y)를 (y–최소값)/(최대값–최소값)으로 0에서 1 사이의 비율로 변환한 후, 개별 시험물질의 반수영향농도를 SPSS 프로그램(IBM SPSS Korea Inc., Korea)의 Probit 분석을 이용하여 산출하였다. 두 가지 물질의 혼합독성은 이전 연구15)에 제시된 방법을 참고하여 개별 물질의 성호르몬 EC50 값의 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.6, 3.2배에 해당하는 농도로 각각 혼합하여 노출시켰다. 즉, A물질의 EC50 값의 0.2배+B 물질의 EC50 값의 0.2배, A물질의 EC50 값의 0.4배+B 물질의 EC50 값의 0.4배 형태로 혼합한 것이다. 혼합물의 독성을 정량화하기 위해 아래의 식을 이용하여 독성단위(toxic unit, TU)를 계산하였다. TU 값이 0.8보다 작으면 상승작용(synergistic), 0.8~1.2이면 상가작용(additive), 1.2보다 클 경우 길항작용(antagonistic)으로 해석하였다.28)

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

CA: 혼합물에서 50% 영향이 확인되는 A 물질의 농도

CB: 혼합물에서 50% 영향이 확인되는 B 물질의 농도

EC50A: A 물질의 호르몬 생산에 대한 반수영향농도

EC50B: B 물질의 호르몬 생산에 대한 반수영향농도

5. 개별 및 혼합 시험물질의 유전자 분석

E2의 상승작용이 크게 나타난 OMC+HS, OMC+OS 조합의 독성 기전을 확인하기 위해 세포를 이용하여 스테로이드호르몬 생합성에 관련된 8개 유전자 발현을 확인하였다. 즉, 55 nM의 옥티노세이트(OMC), 110 nM의 호모살레이트(HS), 120 nM의 옥티살레이트(OS), 55 nM의 옥티노세이트(OMC)+110 nM의 호모살레이트(HS) 조합, 55 nM의 옥티노세이트(OMC)+120 nM의 옥티살레이트(OS) 조합에 대해 유전자 발현 변화를 확인하였다. Total RNA isolation kit (Agilent Technologies, Ontario, CA, USA)를 이용하여 total RNA (tRNA)를 추출하였고, PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis 키트(Takara Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)로 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)을 이용하여 기준 유전자(β-actin) 및 8개 유전자(CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP21A2, HSD3B2, 17βHSD, CYP19A1)의 발현을 측정하였다. 사용한 프라이머의 서열을 Table 2에 제시하였다. 96-well qPCR 플레이트에 희석한 cDNA, 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머, SYBR Green real-time PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)를 넣고, ABI 7500 Fast RT-PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용해 증폭하였다. qPCR은 50°C에서 2분 1 cycle, 95°C에서 10분 1 cycle을 구동한 뒤, 95°C 15초 및 60°C 15초의 조건에서 40 cycles을 구동하였다. 농도군에서 대상 유전자의 발현 변화는 기준 유전자의 역치 주기(threshold cycle)를 기준으로 정규화(normalization)한 후, 대조군과 비교하여 상대 정량하였다.

Table 2 Sequences of primers for the gene measurements

FunctionNameAccession no.Full nameSequences
ReferenceΒ-actinNM_001101Beta actinF: CAC TCT TCC AGC CTT CCT TCC
R: AGG TCT TTG CGG ATG TCC AC
SteroidogenesisCYP11A1NM_000781Cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1F: GAG ATG GCA CGC AAC CTG AAG
R: CTT AGT GTC TCC TTG ATG CTG GC
CYP11B1NM_000497Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: CTT CCA GTA CGG CGA CAA
R: CGA CAG TTC CGC ATT CAA
CYP11B2NM_000498Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: TCC AGG TGT GTT CAG TAG TTC C
R: GAA GCC ATC TCT GAG GTC TGT G
CYP17A1NM_000102Cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1F: AGC CGC ACA CCA ACT ATC AG
R: TCA CCG ATG CTG GAG TCA AC
CYP21A2NM_000500Cytochrome P450 family 21 subfamily A member 2F: CGT GGT GCT GAC CCG ACT G
R: GGC TGC ATC TTG AGG ATG ACA C
HSD3B2NM_000198Hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 2F: TGC CAG TCT TCA TCT ACA CCA G
R: TTC CAG AGG CTC TTC TTC GTG
17βHSDNM_000413Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 1F: CTC CCT CTG ACC AGC AAC C
R: TGT GTC TCC CAC GCA ATC TC
CYP19A1NM_000103Cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1F: AGG TGC TAT TGG TCA TCT GCT C
R: TGG TGG AAT CGG GTC TTT ATG G

F: forward, R: reverse.


6. 통계분석

SPSS 프로그램(IBM SPSS Korea Inc.)의 일원분산분석(one-way analysis of variance)을 이용하여 통계분석의 유의성을 판단하였다. Kolmogorov-Smirnov 검정과 Levene 검정으로 정규성과 동질성을 판단한 다음, 일원분산분석(Dunnett’s t-test 사후분석)으로 대조군과 시험군이 유의하게 차이가 나는지 확인하였다. p<0.05일 경우 통계적으로 유의하다고 판단하였으며, 모든 자료는 평균±표준편차로 표현하였다.

1. 유기 UV-filter의 단일물질 독성

아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 24시간 노출된 H295R 세포의 생존율을 Fig. 1에 제시하였다. 아보벤존(AVO) 30 μM 이상, 호모살레이트(HS) 10 μM 이상, 옥티살레이트(OS) 10 μM 이상, 옥티노세이트(OMC) 30 μM 이상일 때 세포 생존율이 90% 미만으로 떨어졌으며, 세포독성이 있다고 판단하였다.

Figure 1.Viability of the H295R cells following treatment with avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). The red line represents the 90% of cell viability.

아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)에 노출된 H295R 세포의 성호르몬 변화를 Fig. 2에 제시하였다. 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS) 100 nM 이상, 옥티노세이트(OMC) 10 nM 이상, 옥토크릴렌(OC) 30 nM 이상에 노출된 H295R 세포의 E2가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. E2 증가에 대한 EC50은 아보벤존(AVO) 105 nM, 호모살레이트(HS) 110 nM, 옥티살레이트(OS) 120 nM, 옥티노세이트(OMC) 55 nM, 옥토크릴렌(OC) 80 nM이었다. 아보벤존(AVO) 300 nM이상에 노출된 H295R 세포는 T가 대조군에 비해 유의하게 증가하였고, 호모살레이트(HS) 100 nM 이상, 옥티살레이트(OS) 30 nM이상에 노출된 H295R 세포에서는 T가 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 아보벤존(AVO)의 T 증가에 대한 EC50은 650 nM, 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)의T 감소에 대한 EC50은 각각 190 nM, 260 nM로 확인되었다.

Figure 2.Effects on 17β-estradiol (E2) and testosterone (T) in H295R cells exposed to avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). EC50): median effect concentration. The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.

2. 유기 UV-filter의 혼합 독성

OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, OMC+OC에 노출된 H295R 세포의 성호르몬 E2의 변화를 Fig. 3에 제시하였다. OMC+HS혼합물의 0.4배 이상, OMC+OS 혼합물의 0.8배 이상, OMC+OC 혼합물의 1.0배 이상에 노출된 H295R 세포의 E2가 용매 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. OMC+AVB 혼합물에 노출된 H295R 세포에서는 E2의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. OMC+HS 혼합물의 TU는 0.67, OMC+OS 혼합물의 TU는 0.74로 상승작용이 나타났고, OMC+OC 혼합물의 TU는 0.92로 상가작용이 나타났다.

Figure 3.Effects on 17β-estradiol (E2) in H295R cells exposed to binary mixtures of octinoxate (OMC)+avobenzone (AVB), OMC+homosalate (HS), OMC+octisalate (OC), and OMC+octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.

E2의 상승작용이 크게 나타난 2개의 조합의 독성기전을 설명하기 위해 옥티노세이트(OMC), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS)에서의 유전자 발현 변화를 조사하였고, 그 결과를 Fig. 4에 제시하였다. 55 nM 옥티노세이트(OMC)에 노출된 H295R 세포에서는 시험한 8개의 유전자 모두 2배 이상 유의하게 증가하였다. 110 nM 호모살레이트(HS)에 노출된 H295R 세포에서는 CYP21A2 유전자 발현이 유의하게 증가하였고, 17βHSD, CYP19A1, CYP11B1 유전자 발현이 유의하게 감소하였다. 120 nM 옥티살레이트(OS)에 노출된 H295R 세포에서는 CYP21A2 유전자 발현이 유의하게 감소하였다. 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS) 혼합물은 CYP11A1, CYP17A1, CYP21A2, HSD3B2, 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 유의하게 증가시켰으며, 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS) 혼합물은 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 유의하게 증가시켰다.

Figure 4.Effects on transcription of 8 genes in H295R cells exposed to 55 nM octinoxate (OMC), 110 nM homosalate (HS), 120 nM octisalate (OS), binary mixtures of 55 nM OMC+110 nM HS, and binary mixtures of 55 nM OMC+120 nM OS. The upper rectangle shows the result of the OMC, HS, and OMC+HS combination, and the lower rectangle shows the result of the OMC, OS, and OMC+OS combination.

본 연구에서는 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 에스트로겐성을 지녀 E2를 증가시키고, 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS)는 항안드로겐성을 지녀 T를 감소시킴을 확인하였다. 시험한 5가지 UV-filter의 에스트로겐성은 Collaborative Estrogen Receptor Activity Prediction Project (CERAPP)에서 제안한 in silico 모델링29)과 CompTox EDSP21 dashboard에서 제시한 결과20)와 유사하다. 미국 식품의약국(US FDA)에서는 티타늄디옥사이드, 징크옥사이드와 같은 물리적 UV-filter를 안전하고 효과적인 성분(Generally Recognized As Safe and Effective, GRASE) I으로 분류하였으나, 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)은 ‘긍정적인 GRASE 결정을 내리기에는 안전성 자료가 충분하지 않은 상태(non-GRASE III)’로 분류하였다.19) 아보벤존(AVO)은 UVA1, 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)은 UVB와 UVA2를 막기 위해 사용되고 있으며,30) 본 연구의 결과는 이러한 물질들의 내분비계 교란독성 여부에 대한 충분한 검증이 필요함을 나타낸다.

세포주를 이용한 에스트로겐성, 항안드로겐성 시험에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 아보벤존(AVO, 부틸 메톡시디벤조일메탄)은 HEK293 세포의 에스트로겐 수용체에 직접 결합하여 에스트로겐 agonist로 작용할 수 있음이 보고된 바 있으며,31) 본 연구에서 관찰한 에스트로겐성 유발 결과를 뒷받침한다. 호모살레이트(HS)는 MCF-7 세포(세포증식 EC50가 5.53 μM)32) 및 HEK293 세포(hERα transcription activation의 EC50가 1.6 μM)33)에서 에스트로겐성이 확인되었으며, PALM 세포(hAR antagonist IC50가 2.66 μM)32) 및 yeast hAR transactivation assay34)에서 항안드로겐성이 확인되었다. 본 연구에서도 에스트로겐성(E2 호르몬 증가) 및 항안드로겐성(T 호르몬 감소)이 유사하게 관찰되었으나 E2 호르몬 증가의 EC50 (0.11 μM) 및 T 호르몬 감소의 EC50 (0.19 μM)는 기존 연구보다 10배 정도 낮은 농도에서 확인되었다. 옥티살레이트(OS)는 MCF-7 cell proliferation assay32) 및 yeast hAR transactivation assay34)에서 에스트로겐성이 확인되지 않았으며, PALM 세포의 hAR assay에서는 최대 10 μM까지 안드로겐성 및 항안드로겐성이 확인되지 않았다.32) 그러나 rtERα assay에서는 옥티살레이트(OS)에 대한 본 연구의 결과와 유사하게 약한 에스트로겐성,35) yeast hAR transactivation assay에서는 약한 항안드로겐성이 확인되었다.34) 옥티노세이트(OMC)는 MCF-7 cell proliferation assay,36) HEK293 세포의 hERα transcription assay31)에서 에스트로겐성이 확인되었으며, H295R 세포의 스테로이드호르몬 생합성을 방해함이 확인되었다.37) 옥토크릴렌(OC)은 본 연구의 결과와 유사하게 MCF-7 cell proliferation assay에서 에스트로겐성이 확인되었다.38)

E2를 증가시키는 EC50가 가장 낮은 물질인 옥티노세이트(OMC)와 다른 4개의 물질을 binary mixture로 혼합하였을 때, 옥티노세이트(OMC)와 2가지 살레이트 계열 UV-filter 조합이 E2 호르몬을 크게 증가시킴이 확인되었다. 옥티노세이트(OMC)와 호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)와 옥티살레이트(OS)의 조합이 steroidogenesis 축의 CYP11A1, CYP17A1, 3βHSD2, 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 증가시키고, 이러한 변화가 E2 호르몬의 증가에 영향을 주었을 가능성이 있다. 특히, 에스트론(estrone)을 E2로 변환하는 데 관여하는 17βHSD와 T를 E2로 변환39)시키는 CYP19A1 유전자는 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS) 조합에서 유의하게 증가하였으며, 이러한 유전자 발현의 증가가 E2 증가에 기여했을 가능성이 있다. 흥미로운 점은 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)에 개별로 노출된 세포에서는 17βHSD, CYP19A1 유전자의 발현이 감소하였는데, 두 물질을 옥티노세이트(OMC)와 혼합하였을 때에는 17βHSD, CYP19A1 유전자의 발현이 증가하였다는 것이다. 옥티노세이트(OMC)와 살리실레이트 계열의 UV-filter를 혼합하였을 때 유전자의 발현 방향성이 변화되는 독성 기전에 대해서는 추후 자세한 연구가 필요하다.

옥티노세이트(OMC)와 호모살레이트(HS)를 혼합하였을 때 17βHSD, CYP19A1 유전자 외에 CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2 유전자가 유의하게 증가한 것은 이 두 물질의 조합이 steroidogenesis 상위 단계에서부터 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. H295R 세포에서 발현되는 CYP17A1은 CYP17 효소의 전사체로, CYP17은 글루코코르티코이드 합성에 필요한 17α-hydroxylase 활성 및 성호르몬 합성에 필요한 17,20 lyase 활성을 촉매한다.40) HSD3B2 유전자 발현이 증가한 것은 프로게스테론(progesterone), 17α-히드록시프로게스테론(17α-hydroxyprogesterone), 안드로스테네디온(androstenedione)이 증가함을 나타낸다.37) 두 물질의 혼합이 이러한 유전자들에 직접적으로 영향을 준 것인지 아니면 더 상위단계에서의 호르몬 또는 효소에 일차적인 영향을 준 후 간접적인 영향으로 나타난 것인지에 대해서는 추후 연구가 필요하다. 본 연구에서 E2 호르몬의 상승작용이 확인된 농도는 환경 중에서 검출되는 수준보다 높지만, 시중에서 판매되는 자외선 차단제에 자주 혼합되는 조합의 혼합독성을 살펴보았다는 점에서 의의가 있다. 일반적으로 자외선 차단제에는 세 가지 이상의 활성성분이 혼합되어 사용되므로, 더 많은 조합에서 나타나는 독성 변화를 추후에 살펴볼 필요가 있다.

본 연구에서는 H295R 세포를 활용하여 5가지 화학적 자외선 차단제의 성분에 대한 단일 및 혼합 노출 시 성호르몬 내분비계 독성 변화를 확인하였다. E2 호르몬을 증가시키는 능력은 옥티노세이트(OMC)>옥토크릴렌(OC)>아보벤존(AVO)>호모살레이트(HS)>옥티살레이트(OS) 순이었으며, 옥티노세이트(OMC)가 살레이트 계열의 2가지 물질과 혼합될 때 E2 호르몬이 더욱 증가되었다. 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)는 T 호르몬을 감소시켜 항안드로겐성이 확인되었다. H295R 세포의 성호르몬 증가/감소에 대한 EC50를 활용해 TU를 산출하는 방법은 추후 환경오염물질의 혼합 내분비계 교란독성을 확인하는 데 활용할 수 있다.

본 연구는 한국연구재단(RS-2023-00251751)의 지원을 받아 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

이봄이(연구원), 이인혜(연구원, 대학원생), 지경희(교수)

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Article

Original Article

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Published online June 30, 2024 https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Copyright © The Korean Society of Environmental Health.

Evaluation of Single and Binary Mixture Toxicity of Organic UV-Filters Using H295R Cells

Bomee Lee1 , Inhye Lee1,2 , Kyunghee Ji3*

1Institute of Natural Sciences, Yongin University, 2Department of Environmental Health Sciences, School of Public Health, Seoul National University, 3Department of Occupational and Environmental Health, Yongin University

Correspondence to:*Department of Occupational and Environmental Health, Yongin University, 134 Yongindaehak-ro, Cheoin-gu, Yongin 17092, Republic of Korea
Tel: +82-31-8020-2747
Fax: +82-31-8020-2886
E-mail: kyungheeji@yongin.ac.kr

Received: May 13, 2024; Revised: June 6, 2024; Accepted: June 18, 2024

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Background: Organic ultraviolet (UV) filters are widely used in sunscreen products and have been identified as an emerging contaminant. Organic UV filters co-exist with multiple components, but their mixture toxicity remains largely unknown.
Objectives: We investigated the toxicity of single and binary mixtures of commonly used UV-filters using the human adrenocarcinoma (H295R) cell line.
Methods: After exposure to non-cytotoxic concentrations of avobenzone (AVO), homosalate (HS), octisalate (OS), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC), the levels of testosterone (T) and 17β-estradiol (E2) were measured. The median effective concentration (EC50) values for the E2 of the individual substances were used to determine the mixture effect of four binary combinations: OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, and OMC+OC. The synergistic, additive, and antagonistic effects of the mixture were determined by calculating toxic units (TU). To examine the mechanism of mixture toxicity, eight genes involved in steroidogenesis were analyzed using the real-time polymerase chain reaction.
Results: The significant increase in E2 in H295R cells exposed to AVO, HS, OS, OMC, and OC suggest an estrogenic effect of the tested UV-filters. A significant decrease in T was observed in cells exposed to HS and OS. EC50 values for E2 increase were 105 nM for AVO, 110 nM for HS, 120 nM for OS, 55 nM for OMC, and 80 nM for OC. Both binary mixtures consisting of OMC+HS and OMC+OS have synergistic effects.
Conclusions: Our results showed that five types of UV-filter substances increase E2 in H295R cells. We examined the mixture toxicity in terms of increased estrogenicity and confirmed that E2 significantly increased when OMC was mixed with a salicylate-based UV-filters. These findings highlight the importance of determining the impact of UV filter mixtures.

Keywords: Mixture, sex hormone, steroidogenesis, UV filter

I. 서 론

자외선 차단제에는 자외선의 피부 흡수를 막기 위한 활성 성분과 비활성 성분이 혼합되어 있다.1) 자외선 차단제의 활성 성분은 UV-filter로, 물리적 UV-filter와 화학적 UV-filter로 분류된다.2) 물리적 UV-filter는 피부 표면에 보호막을 형성하여 자외선을 반사시키며, 티타늄디옥사이드(titanium dioxide)와 징크옥사이드(zinc oxide)가 주로 사용된다.3) 화학적 UV-filter는 피부에 흡수된 자외선 에너지를 열 형태로 변환하여 밖으로 내보내며, 아보벤존(avobenzone, AVO), 호모살레이트(homosalate, HS), 옥티살레이트(octisalate, OS), 옥티노세이트(octinoxate, OMC), 옥토크릴렌(octocrylene, OC) 등의 성분들이 주로 사용된다.4) 개별물질은 좁은 범위의 자외선 파장만을 흡수하기 때문에 광안정성과 더 넓은 범위의 자외선을 차단하기 위한 목적으로 여러 UV-filter를 섞어 쓰게 된다.5)

UV-filter는 해양 레크리에이션 활동6) 또는 폐수처리장에서 불완전하게 제거되어 물 환경을 오염시킬 수 있다.7) 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)의 지표수(surface water) 검출 수준을 Table 1에 제시하였다. 아보벤존(AVO)은 하와이 해변에서 최대 70,970 ng/L,8) 튀니지 지표수에서 최대 97.7 ng/L9)가 검출되었다. 호모살레이트(HS)는 홍콩 지표수에서 최대 2,812 ng/L,10,11) 하와이 해변에서 최대 686.6 ng/L,12) 체서피크만에서 최대 187.9 ng/L,13) Qinhuai 강과 Yangtze 강에서 최대 3.1 ng/L14)가 검출되었다. 옥티살레이트(OS)는 호모살레이트(HS)보다 비교적 낮은 농도로 검출되었으며, 홍콩 지표수에서 최대 1,030 ng/L,10,11) 하와의 해변에서 최대 121.2 ng/L12)로 확인되었다. 옥티노세이트(OMC)는 홍콩 지표수에서 최대 4,043 ng/L,10,11) 튀니지에서 1,420 ng/L,9) 체서피크만에서 28.9 ng/L,13) Qinhuai 강과 Yangtze 강에서 7.9 ng/L14)로 검출되었다. 옥토크릴렌(OC)은 하와이 해변에서 최대 13,350 ng/L,8) 홍콩 지표수에서 최대 6,812 ng/L10)로 검출되었다.

Table 1 . Concentration of avobenzone, homosalate, octisalate, octinoxate, and octocrylene in the water environment.

ChemicalsLocationNDF (%)Concentration (ng/L)
AM (min-max)
Ref.
AvobenzoneWaialea Bay, Hawaii, USA310022,020 (3,430~35,190)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,740 (3,320~5,160)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA510026,372 (9,400~70,970)8)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia65.5616.3 (9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Tunisia65.563.6 (9)
HomosalateHong Kong, China6076NA (66~2,812)10)
Tokyo, Japan8100NA (65~110)10)
New York, USA667NA (91~114)10)
Los Angeles, USA4100NA (142~270)10)
Bangkok, Thailand2100NA (29~59)10)
Hong Kong, China367516.18 (3.6~41.84)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA18100171.1 (38.5~465.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2114.261.5 (12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA18100215.4 (93.7~686.6)12)
Chesapeake Bay, USA1410090.2 (15.5~187.9)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (1.1~3.1)14)
OctisalateHong Kong, China6059NA (61~1,030)10)
Tokyo, Japan888NA (71~95)10)
Los Angeles, USA450NA (53~120)10)
Chaozhou, China367NA (121~128)10)
Bangkok, Thailand2100NA (28~56)10)
Hong Kong, China365312.74 (0.85~27.78)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA1810055.8 (27.5~121.2)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA1810053.4 (39.1~79.1)12)
Waialea Bay, Hawaii, USA31002,360 (1,400~3,600)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21003,400 (1,700~5,100)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51005,420 (1,100~13,600)8)
OctinoxateHong Kong, China6093NA (89~4,043)10)
Tokyo, Japan863NA (46~95)10)
New York, USA683NA (89~150)10)
Los Angeles, USA475NA (91~138)10)
Shantou, China475NA (52~78)10)
Chaozhou, China333NA (10)
Bangkok, Thailand2100NA (88~95)10)
Arctic1471NA (25~66)10)
Hong Kong, China366721.53 (3.84~55.65)11)
Chesapeake Bay, USA1492.826.9 (13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (4.5~7.9)14)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia6100583 (188~1,420)9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Mahdia, Tunisia666254 (9)
Hammamet Bay, Mahdia, Tunisia63350.9 (9)
OctocryleneHong Kong, China60100NA (103~6,812)10)
Tokyo, Japan875NA (87~108)10)
New York, USA683NA (117~128)10)
Los Angeles, USA4100NA (145~377)10)
Shantou, China475NA (75~107)10)
Chaozhou, China367NA (36~102)10)
Bangkok, Thailand2100NA (153~205)10)
Arctic1443NA (26~31)10)
Hong Kong, China3610025.00 (2.15~71.90)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA181005.2 (0.3~25.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2185.75.3 (0.3~45.5)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA181008.0 (0.3~29.1)12)
Chesapeake Bay, USA1410024.8 (11.9~43.7)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (0.4~0.9)14)
Waialea Bay, Hawaii, USA31008,090 (2,730~13,350)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,870 (90~3,650)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51007,640 (4,540~12,790)8)

AM: arithmetic mean, DF: detection frequency, LOD: limit of detection, NA: not available, Ref: reference..



최근 화학적 UV-filter가 생식 및 발달독성, 신경독성, 내분비계 교란독성을 유발함을 입증한 연구가 증가하고 있다. 예를 들어, 호모살레이트(HS)는 수컷 제브라피쉬의 테스토스테론(T)을 감소시켜 항안드로겐성을 유발하였다.15) 아보벤존(AVO)과 옥티노세이트(OMC)는 제브라피쉬 치어의 발달을 지연시키고, 갑상선호르몬인 티록신(thyroxine)의 합성과 분비를 감소시켰다.16) 옥티노세이트(OMC)의 광분해산물인 4-methoxybenzaldehyde (4-MBA)는 원물질에 비해 제브라피쉬 배아/치어의 발달독성이 더 크게 나타났으며, 아세틸콜린에스테라제 활성을 저하시키고 산화스트레스를 유발하였다.17) 환경 중에서 검출이 가능한 농도(50 μg/L)의 옥토크릴렌(OC)에 노출된 제브라피쉬에서는 발달 지연, 아세틸콜린에스테라제 활성 저하, 부레와 눈의 조직학적 변화, 산화스트레스 유발이 확인되었다.18) 이러한 독성 자료를 토대로 최근 자외선 차단제 활성 성분의 인체 안전성에 대한 조사가 미국과 유럽을 포함한 여러 기관에서 강화되고 있다. 2019년 미국 식품의약국(US FDA)은 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)을 포함하여 12개 화학적 UV-filter에 대해 추가적인 안전성 자료가 필요하다고 언급했다.19) 유럽 위원회(European Commission)는 추가평가를 요청하는 내분비계 교란물질 목록에 여러 UV-filter를 포함시켰다.20)

제품 뿐만 아니라 환경 중으로 배출된 자외선 차단제는 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 다양한 자외선 차단제 성분이 혼합되었을 때 나타날 수 있는 독성영향에 대해 연구가 필요하다. 최근 몇몇 연구에서는 다빈도로 혼합되는 자외선차단제가 혼합되었을 때 항안드로겐성 등 내분비계 교란독성 증가, 산화스트레스 유발과 지질 및 단백질 손상이 증가할 수 있다고 보고하였다.15,21,22) 예를 들어, 화장품 내에 다빈도로 혼합되는 2-메틸레조르시놀(2-methylresorcinol), 부틸화히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 아보벤존(AVO)의 내분비계 교란독성을 조사한 연구에서는 2-메틸레조르시놀+아보벤존(AVO) 조합이 항안드로겐성을 가짐을 확인하였다.21) 호모살레이트(HS)는 아보벤존(AVO)과 혼합노출될 때 H295R 세포와 수컷 제브라피쉬에서 항안드로겐성이 더욱 증가되었다.15) 아보벤존(AVO)과 나노산화아연(nano ZnO)이 갯지렁이(lugworm)에 혼합 노출되었을 때 산화스트레스가 증가하였고 지질 과산화물이 축적되어 지질 및 단백질 손상이 증가하였다.22) 그러나, 아보벤존(AVO)과 호모살레이트(HS) 이외의 다른 자외선 차단제 성분들에 대한 혼합독성 연구는 부족하다.

본 연구에서는 H295R 세포를 활용하여 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 성호르몬인 17β-estradiol (E2)와 testosterone (T)에 미치는 영향을 확인하였고, 에스트로겐성이 가장 높은 옥티노세이트(OMC)와 다른 물질을 혼합할 때의 E2의 독성 변화를 살펴보았다. H295R 세포는 미분화된 태아 부신 세포의 생물학적 특성을 나타내지만, 성인 부신 피질, 난소, 고환에서 발견되는 스테로이드 호르몬을 생성한다.23) 이 세포는 환경오염물질이 스테로이드 성호르몬 뿐만 아니라 효소 활성 및 유전자 발현에 대한 영향을 평가하는 데 사용되어 왔으며,24,25) OECD 시험지침 456 (H295R steroidogenesis assay)으로 개발되었다.26) 최근에는 ToxCast 프로그램의 일부로 H295R 세포가 고속대량 스크리닝(high-throughput screening)에 활용되고 있다.27) 본 연구에서는 H295R 세포를 이용한 성호르몬 혼합 독성 비교 방법을 제안하였고, 스테로이드호르몬 생합성과 관련된 유전자 발현 변화를 조사하여 독성 기전을 제시하였다.

II. 재료 및 방법

1. 시험물질과 H295R 세포의 배양

시험물질인 아보벤존(AVO, CAS no. 70356-09-1), 호모살레이트(HS, CAS no. 118-56-9), 옥티살레이트(OS, CAS no. 118-60-5), 옥티노세이트(OMC, CAS no. 5466-77-3), 옥토크릴렌(OC, CAS no. 6197-30-4)과 용매로 사용한 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)는 Merck Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMSO에 시험물질을 녹여 저장용액(stock solution)을 제조하였고, 시험용액(test solution)은 저장용액을 DMSO로 희석하여 제조하였다.

H295R 세포(#CRL-2128)는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양받았다. 세포는 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM)과 Ham’s F-12 nutrient medium이 1:1로 혼합된 배지(DMEM/F12; GibcoTM 11320033, Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)에 ITS+premix (Corning® 354352, Corning, NY, USA), 2.5%의 Nu-serum (Corning® 355100), 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하였다. H295R 세포는 5% 이산화탄소-95% 공기, 37°C 조건의 인큐베이터에서 배양하였으며, 세포 confluence가 80% 가량이 되면 분주하였다.

2. MTT 분석을 이용한 세포독성 확인

본 연구에서는 OECD TG 45626)에 따라 H295R 세포를 24-well 플레이트의 각 well에 3.0×105 cells/mL의 밀도로 분주하였다. 세포가 플레이트에 부착될 수 있도록 24시간 동안 5% 이산화탄소-95% 공기, 37°C 조건의 인큐베이터에서 배양한 후, 대조군, 용매 대조군(DMSO 0.1%), 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)의 6개 농도(0.3, 1, 3, 10, 30, 100 μM)에 48시간 노출하였다. 각 농도군 당 3개의 반복군을 두었으며, 3번의 반복 실험을 통해 총 9개의 반복군을 확보하였다. 노출이 종료된 후 MTT 분석을 통해 세포의 생존율을 확인하였다. MTT 분석에서 세포 독성이 없는 농도(즉, 용매 대조군과 비교하여 세포 생존율이 90% 이상)를 성호르몬 분석을 위한 노출 농도로 지정하였다.

3. 개별 시험물질 노출과 성호르몬 분석

개별 시험물질 노출과 성호르몬 분석은 OECD TG 456에 제시된 방법26)에 따라 진행하였다. 즉, H295R 세포를 24-well 플레이트의 각 well에 3.0×105 cells/mL의 밀도로 분주하여 24시간 동안 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 대조군, 용매 대조군(DMSO 0.1%), 아보벤존(AVO; 10, 30, 100, 300, 1,000, 3,000 nM), 호모살레이트(HS; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥티살레이트(OS; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥티노세이트(OMC; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM), 옥토크릴렌(OC; 3, 10, 30, 100, 300, 1,000 nM)에 48시간 노출하였다. 각 농도군 당 3개의 반복군을 두었으며, 3번의 반복 실험을 통해 총 9개의 반복군을 확보하였다. 시험이 종료된 후 배지를 수집하여 성호르몬 분석에 사용하였다.

배지(500 μL)를 2.5 mL의 디에틸에테르(diethyl ether)로 2번 추출하고, 질소농축기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 효소결합면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)에 동봉된 완충액(buffer) 300 μL로 녹인 후, E2 분석을 위한 시료는 1:1로, T 분석을 위한 시료는 1:75로 희석하였다. 호르몬은 ELISA 키트의 매뉴얼에 따라 E2 (Cat 번호 582251) 및 T (Cat 번호 582701)를 분석하였다.

4. 혼합 시험물질 노출과 성호르몬 분석

개별 시험물질 중 E2에 대한 반수영향농도(median effect concentration EC50) 값이 가장 낮아 에스트로겐성이 가장 큰 것으로 확인된 물질(옥티노세이트[OMC])을 중심으로 다른 물질을 혼합하여 다른 4개의 물질을 binary mixture로 혼합하였다(OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, OMC+OC). 호르몬 변화(y)를 (y–최소값)/(최대값–최소값)으로 0에서 1 사이의 비율로 변환한 후, 개별 시험물질의 반수영향농도를 SPSS 프로그램(IBM SPSS Korea Inc., Korea)의 Probit 분석을 이용하여 산출하였다. 두 가지 물질의 혼합독성은 이전 연구15)에 제시된 방법을 참고하여 개별 물질의 성호르몬 EC50 값의 0.2, 0.4, 0.8, 1.0, 1.6, 3.2배에 해당하는 농도로 각각 혼합하여 노출시켰다. 즉, A물질의 EC50 값의 0.2배+B 물질의 EC50 값의 0.2배, A물질의 EC50 값의 0.4배+B 물질의 EC50 값의 0.4배 형태로 혼합한 것이다. 혼합물의 독성을 정량화하기 위해 아래의 식을 이용하여 독성단위(toxic unit, TU)를 계산하였다. TU 값이 0.8보다 작으면 상승작용(synergistic), 0.8~1.2이면 상가작용(additive), 1.2보다 클 경우 길항작용(antagonistic)으로 해석하였다.28)

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

CA: 혼합물에서 50% 영향이 확인되는 A 물질의 농도

CB: 혼합물에서 50% 영향이 확인되는 B 물질의 농도

EC50A: A 물질의 호르몬 생산에 대한 반수영향농도

EC50B: B 물질의 호르몬 생산에 대한 반수영향농도

5. 개별 및 혼합 시험물질의 유전자 분석

E2의 상승작용이 크게 나타난 OMC+HS, OMC+OS 조합의 독성 기전을 확인하기 위해 세포를 이용하여 스테로이드호르몬 생합성에 관련된 8개 유전자 발현을 확인하였다. 즉, 55 nM의 옥티노세이트(OMC), 110 nM의 호모살레이트(HS), 120 nM의 옥티살레이트(OS), 55 nM의 옥티노세이트(OMC)+110 nM의 호모살레이트(HS) 조합, 55 nM의 옥티노세이트(OMC)+120 nM의 옥티살레이트(OS) 조합에 대해 유전자 발현 변화를 확인하였다. Total RNA isolation kit (Agilent Technologies, Ontario, CA, USA)를 이용하여 total RNA (tRNA)를 추출하였고, PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis 키트(Takara Korea Biomedical Inc., Seoul, Korea)로 complementary DNA (cDNA)를 합성하였다. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)을 이용하여 기준 유전자(β-actin) 및 8개 유전자(CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP21A2, HSD3B2, 17βHSD, CYP19A1)의 발현을 측정하였다. 사용한 프라이머의 서열을 Table 2에 제시하였다. 96-well qPCR 플레이트에 희석한 cDNA, 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머, SYBR Green real-time PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Korea, Seoul, Korea)를 넣고, ABI 7500 Fast RT-PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용해 증폭하였다. qPCR은 50°C에서 2분 1 cycle, 95°C에서 10분 1 cycle을 구동한 뒤, 95°C 15초 및 60°C 15초의 조건에서 40 cycles을 구동하였다. 농도군에서 대상 유전자의 발현 변화는 기준 유전자의 역치 주기(threshold cycle)를 기준으로 정규화(normalization)한 후, 대조군과 비교하여 상대 정량하였다.

Table 2 . Sequences of primers for the gene measurements.

FunctionNameAccession no.Full nameSequences
ReferenceΒ-actinNM_001101Beta actinF: CAC TCT TCC AGC CTT CCT TCC
R: AGG TCT TTG CGG ATG TCC AC
SteroidogenesisCYP11A1NM_000781Cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1F: GAG ATG GCA CGC AAC CTG AAG
R: CTT AGT GTC TCC TTG ATG CTG GC
CYP11B1NM_000497Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: CTT CCA GTA CGG CGA CAA
R: CGA CAG TTC CGC ATT CAA
CYP11B2NM_000498Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: TCC AGG TGT GTT CAG TAG TTC C
R: GAA GCC ATC TCT GAG GTC TGT G
CYP17A1NM_000102Cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1F: AGC CGC ACA CCA ACT ATC AG
R: TCA CCG ATG CTG GAG TCA AC
CYP21A2NM_000500Cytochrome P450 family 21 subfamily A member 2F: CGT GGT GCT GAC CCG ACT G
R: GGC TGC ATC TTG AGG ATG ACA C
HSD3B2NM_000198Hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 2F: TGC CAG TCT TCA TCT ACA CCA G
R: TTC CAG AGG CTC TTC TTC GTG
17βHSDNM_000413Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 1F: CTC CCT CTG ACC AGC AAC C
R: TGT GTC TCC CAC GCA ATC TC
CYP19A1NM_000103Cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1F: AGG TGC TAT TGG TCA TCT GCT C
R: TGG TGG AAT CGG GTC TTT ATG G

F: forward, R: reverse..



6. 통계분석

SPSS 프로그램(IBM SPSS Korea Inc.)의 일원분산분석(one-way analysis of variance)을 이용하여 통계분석의 유의성을 판단하였다. Kolmogorov-Smirnov 검정과 Levene 검정으로 정규성과 동질성을 판단한 다음, 일원분산분석(Dunnett’s t-test 사후분석)으로 대조군과 시험군이 유의하게 차이가 나는지 확인하였다. p<0.05일 경우 통계적으로 유의하다고 판단하였으며, 모든 자료는 평균±표준편차로 표현하였다.

III. 결 과

1. 유기 UV-filter의 단일물질 독성

아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 24시간 노출된 H295R 세포의 생존율을 Fig. 1에 제시하였다. 아보벤존(AVO) 30 μM 이상, 호모살레이트(HS) 10 μM 이상, 옥티살레이트(OS) 10 μM 이상, 옥티노세이트(OMC) 30 μM 이상일 때 세포 생존율이 90% 미만으로 떨어졌으며, 세포독성이 있다고 판단하였다.

Figure 1. Viability of the H295R cells following treatment with avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). The red line represents the 90% of cell viability.

아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)에 노출된 H295R 세포의 성호르몬 변화를 Fig. 2에 제시하였다. 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS) 100 nM 이상, 옥티노세이트(OMC) 10 nM 이상, 옥토크릴렌(OC) 30 nM 이상에 노출된 H295R 세포의 E2가 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. E2 증가에 대한 EC50은 아보벤존(AVO) 105 nM, 호모살레이트(HS) 110 nM, 옥티살레이트(OS) 120 nM, 옥티노세이트(OMC) 55 nM, 옥토크릴렌(OC) 80 nM이었다. 아보벤존(AVO) 300 nM이상에 노출된 H295R 세포는 T가 대조군에 비해 유의하게 증가하였고, 호모살레이트(HS) 100 nM 이상, 옥티살레이트(OS) 30 nM이상에 노출된 H295R 세포에서는 T가 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 아보벤존(AVO)의 T 증가에 대한 EC50은 650 nM, 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)의T 감소에 대한 EC50은 각각 190 nM, 260 nM로 확인되었다.

Figure 2. Effects on 17β-estradiol (E2) and testosterone (T) in H295R cells exposed to avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). EC50): median effect concentration. The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.

2. 유기 UV-filter의 혼합 독성

OMC+AVB, OMC+HS, OMC+OS, OMC+OC에 노출된 H295R 세포의 성호르몬 E2의 변화를 Fig. 3에 제시하였다. OMC+HS혼합물의 0.4배 이상, OMC+OS 혼합물의 0.8배 이상, OMC+OC 혼합물의 1.0배 이상에 노출된 H295R 세포의 E2가 용매 대조군에 비해 유의하게 증가하였다. OMC+AVB 혼합물에 노출된 H295R 세포에서는 E2의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. OMC+HS 혼합물의 TU는 0.67, OMC+OS 혼합물의 TU는 0.74로 상승작용이 나타났고, OMC+OC 혼합물의 TU는 0.92로 상가작용이 나타났다.

Figure 3. Effects on 17β-estradiol (E2) in H295R cells exposed to binary mixtures of octinoxate (OMC)+avobenzone (AVB), OMC+homosalate (HS), OMC+octisalate (OC), and OMC+octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.

E2의 상승작용이 크게 나타난 2개의 조합의 독성기전을 설명하기 위해 옥티노세이트(OMC), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS)에서의 유전자 발현 변화를 조사하였고, 그 결과를 Fig. 4에 제시하였다. 55 nM 옥티노세이트(OMC)에 노출된 H295R 세포에서는 시험한 8개의 유전자 모두 2배 이상 유의하게 증가하였다. 110 nM 호모살레이트(HS)에 노출된 H295R 세포에서는 CYP21A2 유전자 발현이 유의하게 증가하였고, 17βHSD, CYP19A1, CYP11B1 유전자 발현이 유의하게 감소하였다. 120 nM 옥티살레이트(OS)에 노출된 H295R 세포에서는 CYP21A2 유전자 발현이 유의하게 감소하였다. 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS) 혼합물은 CYP11A1, CYP17A1, CYP21A2, HSD3B2, 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 유의하게 증가시켰으며, 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS) 혼합물은 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 유의하게 증가시켰다.

Figure 4. Effects on transcription of 8 genes in H295R cells exposed to 55 nM octinoxate (OMC), 110 nM homosalate (HS), 120 nM octisalate (OS), binary mixtures of 55 nM OMC+110 nM HS, and binary mixtures of 55 nM OMC+120 nM OS. The upper rectangle shows the result of the OMC, HS, and OMC+HS combination, and the lower rectangle shows the result of the OMC, OS, and OMC+OS combination.

IV. 고 찰

본 연구에서는 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)이 에스트로겐성을 지녀 E2를 증가시키고, 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS)는 항안드로겐성을 지녀 T를 감소시킴을 확인하였다. 시험한 5가지 UV-filter의 에스트로겐성은 Collaborative Estrogen Receptor Activity Prediction Project (CERAPP)에서 제안한 in silico 모델링29)과 CompTox EDSP21 dashboard에서 제시한 결과20)와 유사하다. 미국 식품의약국(US FDA)에서는 티타늄디옥사이드, 징크옥사이드와 같은 물리적 UV-filter를 안전하고 효과적인 성분(Generally Recognized As Safe and Effective, GRASE) I으로 분류하였으나, 아보벤존(AVO), 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)은 ‘긍정적인 GRASE 결정을 내리기에는 안전성 자료가 충분하지 않은 상태(non-GRASE III)’로 분류하였다.19) 아보벤존(AVO)은 UVA1, 호모살레이트(HS), 옥티살레이트(OS), 옥티노세이트(OMC), 옥토크릴렌(OC)은 UVB와 UVA2를 막기 위해 사용되고 있으며,30) 본 연구의 결과는 이러한 물질들의 내분비계 교란독성 여부에 대한 충분한 검증이 필요함을 나타낸다.

세포주를 이용한 에스트로겐성, 항안드로겐성 시험에서도 유사한 결과가 관찰되었다. 아보벤존(AVO, 부틸 메톡시디벤조일메탄)은 HEK293 세포의 에스트로겐 수용체에 직접 결합하여 에스트로겐 agonist로 작용할 수 있음이 보고된 바 있으며,31) 본 연구에서 관찰한 에스트로겐성 유발 결과를 뒷받침한다. 호모살레이트(HS)는 MCF-7 세포(세포증식 EC50가 5.53 μM)32) 및 HEK293 세포(hERα transcription activation의 EC50가 1.6 μM)33)에서 에스트로겐성이 확인되었으며, PALM 세포(hAR antagonist IC50가 2.66 μM)32) 및 yeast hAR transactivation assay34)에서 항안드로겐성이 확인되었다. 본 연구에서도 에스트로겐성(E2 호르몬 증가) 및 항안드로겐성(T 호르몬 감소)이 유사하게 관찰되었으나 E2 호르몬 증가의 EC50 (0.11 μM) 및 T 호르몬 감소의 EC50 (0.19 μM)는 기존 연구보다 10배 정도 낮은 농도에서 확인되었다. 옥티살레이트(OS)는 MCF-7 cell proliferation assay32) 및 yeast hAR transactivation assay34)에서 에스트로겐성이 확인되지 않았으며, PALM 세포의 hAR assay에서는 최대 10 μM까지 안드로겐성 및 항안드로겐성이 확인되지 않았다.32) 그러나 rtERα assay에서는 옥티살레이트(OS)에 대한 본 연구의 결과와 유사하게 약한 에스트로겐성,35) yeast hAR transactivation assay에서는 약한 항안드로겐성이 확인되었다.34) 옥티노세이트(OMC)는 MCF-7 cell proliferation assay,36) HEK293 세포의 hERα transcription assay31)에서 에스트로겐성이 확인되었으며, H295R 세포의 스테로이드호르몬 생합성을 방해함이 확인되었다.37) 옥토크릴렌(OC)은 본 연구의 결과와 유사하게 MCF-7 cell proliferation assay에서 에스트로겐성이 확인되었다.38)

E2를 증가시키는 EC50가 가장 낮은 물질인 옥티노세이트(OMC)와 다른 4개의 물질을 binary mixture로 혼합하였을 때, 옥티노세이트(OMC)와 2가지 살레이트 계열 UV-filter 조합이 E2 호르몬을 크게 증가시킴이 확인되었다. 옥티노세이트(OMC)와 호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)와 옥티살레이트(OS)의 조합이 steroidogenesis 축의 CYP11A1, CYP17A1, 3βHSD2, 17βHSD, CYP19A1 유전자 발현을 증가시키고, 이러한 변화가 E2 호르몬의 증가에 영향을 주었을 가능성이 있다. 특히, 에스트론(estrone)을 E2로 변환하는 데 관여하는 17βHSD와 T를 E2로 변환39)시키는 CYP19A1 유전자는 옥티노세이트(OMC)+호모살레이트(HS), 옥티노세이트(OMC)+옥티살레이트(OS) 조합에서 유의하게 증가하였으며, 이러한 유전자 발현의 증가가 E2 증가에 기여했을 가능성이 있다. 흥미로운 점은 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)에 개별로 노출된 세포에서는 17βHSD, CYP19A1 유전자의 발현이 감소하였는데, 두 물질을 옥티노세이트(OMC)와 혼합하였을 때에는 17βHSD, CYP19A1 유전자의 발현이 증가하였다는 것이다. 옥티노세이트(OMC)와 살리실레이트 계열의 UV-filter를 혼합하였을 때 유전자의 발현 방향성이 변화되는 독성 기전에 대해서는 추후 자세한 연구가 필요하다.

옥티노세이트(OMC)와 호모살레이트(HS)를 혼합하였을 때 17βHSD, CYP19A1 유전자 외에 CYP11A1, CYP17A1, HSD3B2 유전자가 유의하게 증가한 것은 이 두 물질의 조합이 steroidogenesis 상위 단계에서부터 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. H295R 세포에서 발현되는 CYP17A1은 CYP17 효소의 전사체로, CYP17은 글루코코르티코이드 합성에 필요한 17α-hydroxylase 활성 및 성호르몬 합성에 필요한 17,20 lyase 활성을 촉매한다.40) HSD3B2 유전자 발현이 증가한 것은 프로게스테론(progesterone), 17α-히드록시프로게스테론(17α-hydroxyprogesterone), 안드로스테네디온(androstenedione)이 증가함을 나타낸다.37) 두 물질의 혼합이 이러한 유전자들에 직접적으로 영향을 준 것인지 아니면 더 상위단계에서의 호르몬 또는 효소에 일차적인 영향을 준 후 간접적인 영향으로 나타난 것인지에 대해서는 추후 연구가 필요하다. 본 연구에서 E2 호르몬의 상승작용이 확인된 농도는 환경 중에서 검출되는 수준보다 높지만, 시중에서 판매되는 자외선 차단제에 자주 혼합되는 조합의 혼합독성을 살펴보았다는 점에서 의의가 있다. 일반적으로 자외선 차단제에는 세 가지 이상의 활성성분이 혼합되어 사용되므로, 더 많은 조합에서 나타나는 독성 변화를 추후에 살펴볼 필요가 있다.

V. 결 론

본 연구에서는 H295R 세포를 활용하여 5가지 화학적 자외선 차단제의 성분에 대한 단일 및 혼합 노출 시 성호르몬 내분비계 독성 변화를 확인하였다. E2 호르몬을 증가시키는 능력은 옥티노세이트(OMC)>옥토크릴렌(OC)>아보벤존(AVO)>호모살레이트(HS)>옥티살레이트(OS) 순이었으며, 옥티노세이트(OMC)가 살레이트 계열의 2가지 물질과 혼합될 때 E2 호르몬이 더욱 증가되었다. 호모살레이트(HS)와 옥티살레이트(OS)는 T 호르몬을 감소시켜 항안드로겐성이 확인되었다. H295R 세포의 성호르몬 증가/감소에 대한 EC50를 활용해 TU를 산출하는 방법은 추후 환경오염물질의 혼합 내분비계 교란독성을 확인하는 데 활용할 수 있다.

감사의 글

본 연구는 한국연구재단(RS-2023-00251751)의 지원을 받아 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

CONFLICT OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

저자정보

이봄이(연구원), 이인혜(연구원, 대학원생), 지경희(교수)

Fig 1.

Figure 1.Viability of the H295R cells following treatment with avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). The red line represents the 90% of cell viability.
Journal of Environmental Health Sciences 2024; 50: 201-211https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Fig 2.

Figure 2.Effects on 17β-estradiol (E2) and testosterone (T) in H295R cells exposed to avobenzone (AVB), homosalate (HS), octisalate (OC), octinoxate (OMC), and octocrylene (OC). EC50): median effect concentration. The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.
Journal of Environmental Health Sciences 2024; 50: 201-211https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Fig 3.

Figure 3.Effects on 17β-estradiol (E2) in H295R cells exposed to binary mixtures of octinoxate (OMC)+avobenzone (AVB), OMC+homosalate (HS), OMC+octisalate (OC), and OMC+octocrylene (OC). The values represent mean±standard deviation (n=9). Asterisk (*) indicates significant difference between solvent control and exposure groups by one-way analysis of variance.
Journal of Environmental Health Sciences 2024; 50: 201-211https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Fig 4.

Figure 4.Effects on transcription of 8 genes in H295R cells exposed to 55 nM octinoxate (OMC), 110 nM homosalate (HS), 120 nM octisalate (OS), binary mixtures of 55 nM OMC+110 nM HS, and binary mixtures of 55 nM OMC+120 nM OS. The upper rectangle shows the result of the OMC, HS, and OMC+HS combination, and the lower rectangle shows the result of the OMC, OS, and OMC+OS combination.
Journal of Environmental Health Sciences 2024; 50: 201-211https://doi.org/10.5668/JEHS.2024.50.3.201

Table 1 Concentration of avobenzone, homosalate, octisalate, octinoxate, and octocrylene in the water environment

ChemicalsLocationNDF (%)Concentration (ng/L)
AM (min-max)
Ref.
AvobenzoneWaialea Bay, Hawaii, USA310022,020 (3,430~35,190)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,740 (3,320~5,160)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA510026,372 (9,400~70,970)8)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia65.5616.3 (9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Tunisia65.563.6 (9)
HomosalateHong Kong, China6076NA (66~2,812)10)
Tokyo, Japan8100NA (65~110)10)
New York, USA667NA (91~114)10)
Los Angeles, USA4100NA (142~270)10)
Bangkok, Thailand2100NA (29~59)10)
Hong Kong, China367516.18 (3.6~41.84)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA18100171.1 (38.5~465.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2114.261.5 (12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA18100215.4 (93.7~686.6)12)
Chesapeake Bay, USA1410090.2 (15.5~187.9)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (1.1~3.1)14)
OctisalateHong Kong, China6059NA (61~1,030)10)
Tokyo, Japan888NA (71~95)10)
Los Angeles, USA450NA (53~120)10)
Chaozhou, China367NA (121~128)10)
Bangkok, Thailand2100NA (28~56)10)
Hong Kong, China365312.74 (0.85~27.78)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA1810055.8 (27.5~121.2)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA1810053.4 (39.1~79.1)12)
Waialea Bay, Hawaii, USA31002,360 (1,400~3,600)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21003,400 (1,700~5,100)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51005,420 (1,100~13,600)8)
OctinoxateHong Kong, China6093NA (89~4,043)10)
Tokyo, Japan863NA (46~95)10)
New York, USA683NA (89~150)10)
Los Angeles, USA475NA (91~138)10)
Shantou, China475NA (52~78)10)
Chaozhou, China333NA (10)
Bangkok, Thailand2100NA (88~95)10)
Arctic1471NA (25~66)10)
Hong Kong, China366721.53 (3.84~55.65)11)
Chesapeake Bay, USA1492.826.9 (13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (4.5~7.9)14)
Gabes Bay, Mahdia, Tunisia6100583 (188~1,420)9)
Between Hammamet and Gabes Bay, Mahdia, Tunisia666254 (9)
Hammamet Bay, Mahdia, Tunisia63350.9 (9)
OctocryleneHong Kong, China60100NA (103~6,812)10)
Tokyo, Japan875NA (87~108)10)
New York, USA683NA (117~128)10)
Los Angeles, USA4100NA (145~377)10)
Shantou, China475NA (75~107)10)
Chaozhou, China367NA (36~102)10)
Bangkok, Thailand2100NA (153~205)10)
Arctic1443NA (26~31)10)
Hong Kong, China3610025.00 (2.15~71.90)11)
Ka’a’awa Bay, Hawaii, USA181005.2 (0.3~25.4)12)
Kaneohe Bay, Hawaii, USA2185.75.3 (0.3~45.5)12)
Waikiki Beach, Hawaii, USA181008.0 (0.3~29.1)12)
Chesapeake Bay, USA1410024.8 (11.9~43.7)13)
Qinhuai and Yangtze River, China9NANA (0.4~0.9)14)
Waialea Bay, Hawaii, USA31008,090 (2,730~13,350)8)
Kealakekua Bay, Hawaii, USA21001,870 (90~3,650)8)
Kahalu’u Beach, Hawaii, USA51007,640 (4,540~12,790)8)

AM: arithmetic mean, DF: detection frequency, LOD: limit of detection, NA: not available, Ref: reference.


Table 2 Sequences of primers for the gene measurements

FunctionNameAccession no.Full nameSequences
ReferenceΒ-actinNM_001101Beta actinF: CAC TCT TCC AGC CTT CCT TCC
R: AGG TCT TTG CGG ATG TCC AC
SteroidogenesisCYP11A1NM_000781Cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1F: GAG ATG GCA CGC AAC CTG AAG
R: CTT AGT GTC TCC TTG ATG CTG GC
CYP11B1NM_000497Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: CTT CCA GTA CGG CGA CAA
R: CGA CAG TTC CGC ATT CAA
CYP11B2NM_000498Cytochrome P450 family 11 subfamily B member 1F: TCC AGG TGT GTT CAG TAG TTC C
R: GAA GCC ATC TCT GAG GTC TGT G
CYP17A1NM_000102Cytochrome P450 family 17 subfamily A member 1F: AGC CGC ACA CCA ACT ATC AG
R: TCA CCG ATG CTG GAG TCA AC
CYP21A2NM_000500Cytochrome P450 family 21 subfamily A member 2F: CGT GGT GCT GAC CCG ACT G
R: GGC TGC ATC TTG AGG ATG ACA C
HSD3B2NM_000198Hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta- and steroid delta-isomerase 2F: TGC CAG TCT TCA TCT ACA CCA G
R: TTC CAG AGG CTC TTC TTC GTG
17βHSDNM_000413Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 1F: CTC CCT CTG ACC AGC AAC C
R: TGT GTC TCC CAC GCA ATC TC
CYP19A1NM_000103Cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1F: AGG TGC TAT TGG TCA TCT GCT C
R: TGG TGG AAT CGG GTC TTT ATG G

F: forward, R: reverse.


References

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The Korean Society of Environmental Health

Vol.50 No.3
June, 2024

pISSN 1738-4087
eISSN 2233-8616

Frequency: Bimonthly

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